【摘要】目的：研究白藜芦醇(RES)对于异抗原刺激下大鼠T淋巴细胞NFκB表达的影响。方法：建立SD-Wistar大鼠腹腔异位心脏移植模型急性排斥反应模型，分离受体脾脏淋巴细胞与成年供体系SD大鼠心肌细胞体外混合培养，分别给予不同剂量RES与CsA干预，通过免疫组化方法测定RES与CsA对体外混合培养下T淋巴细胞NFκB表达。结果：不同剂量RES对T淋巴细胞NFκB表达影响具有统计学意义。 结论：RES对体外培养中异抗原刺激的T淋巴细胞NFκB表达有影响 
【关键词】白藜芦醇；异抗原；NFκB 
The effects of resveratrol on the expression of NFκB of T lymphocytes stimulated by alloantigen  YouLi Wang, YanHong Zhao, XingWu Yang, Jian Hua Wang,Chang Xue Wu. Department of hepatobiliary Surgery,Shaanxi traditional medicine college AFF hospital, Xianyang 712000.China
【Abstract】 Objective: To investigate the effect of RES on the apoptosis of T lymphocytes stimulated by alloantigen.  Method: The models of acute rejection of SD-Wistar heterotopic cardiac transplantation in rats’ abdomen were set up, the spleen cells from the receptor Wister rats and the cardiomyocytes from the giver adult SD rats were separated to be mixed cultured in vitro, and different doses of RES and CsA were employed as interference means.  The influences of RES and CsA on the expression of NFκB were observed through imunnohistochemistry stain.  Results: Different group of RES and CSA can obviously reduce the activity of NFκB in T lymphocytes, CSA is above RES. Conclusion: RES can inhibit the expression of NF-κB in T lymphocytes stimulated by different antigen in vitro.  
【Keywords】RES；alloantigen；NFκB  
白藜芦醇(resveratro, RES )含芪类结构的非黄酮类多酚化合物，主要来源于蓼科植物虎杖的根茎提取物，具有广泛的生理药理学作用，但对免疫系统的调节作用研究较少，我们初步探讨了RES对异抗原刺激下T淋巴细胞NFκB表达的影响。 
1 材料与方法
1.1材料：白藜芦醇、 胶原酶均购自Sigma公司, SABC免疫组化染色试剂盒购自博士德生
咸阳市科技局资助项目：编号：XK07015-1（4）
陕西省卫生厅资助项目，类号04D47
通讯作者：王幼黎，1970年生，男，汉族，陕西省西安市人，副主任医师，博士，研究方向：中医药对器官移植排斥反应的影响。
物工程有限公司，Q550CW图像信号采集与分析系统购自LecCA公司。 
1.2 方法： 
1.2.1 SD大鼠对Wistar大鼠异位腹腔心脏移植模型的建立
1.2.1.1 材料与方法
供体采用健康纯系清洁级SD大鼠，体重约180～220g，雌性，购于西安交通大学动物实验中心。受体选用健康纯系清洁级Wistar大鼠，雄性,体重约180～220g，购于北京试验动物中心。供受体术前禁食8-12小时,自由进水。供受体麻醉采用氯安酮（50mg/kg）腹腔注射，手术在清洁条件下进行。
1.2.1.2 供体手术
SD大鼠麻醉后, 由下腔静脉全身肝素化后,于胸主动脉根部切断主动脉及下腔静脉, 将心脏、肺脏以及胸腺组织联合切取。
1.2.1.3 供心体外修剪及心脏保存
供心置于0-4℃无菌乳酸林格氏液修整, 分离升主动脉及肺动脉, 游离并结扎左肺动脉,游离保留右肺动脉,长度约6～8mm作为流出道。将胸主动脉干上左颈总动脉分支（第二分支）修剪保留至约3mm,做为流入道,并将胸主动脉远端结扎.上、下腔静脉和所有肺静脉一次集束结扎, 制作直径为3mm的Cuff套管,将右肺动脉穿过套管,并将动脉近端翻转包绕Cuff套管,丝线结扎固定，经Cuff套管经右肺动脉使用0-4℃无菌乳酸林格氏液供心灌注驱血。
1.2.1.4 受体手术
Wistar大鼠麻醉后, 左腹部T形切口, 游离左肾动、静脉, 近肾门处切断左肾动静脉, 左肾切除。供心左颈总动脉与受体左肾动脉以袖套法吻合，受体左肾动脉末端套入供心左颈总动脉（第二分支），将供心右肺动脉Cuff套管插入受体左肾静脉结扎固定，依次开放左肾动脉、左肾静脉，供心节律性收缩后，关腹，自由进食饮水。
1.2.2 受体Wistar大鼠淋巴细胞分离与培养
1.2.2.1  受体Wistar大鼠无菌脾细胞悬液制备
术后第7天，处死大鼠消毒后,无菌开腹取脾，Hanks液洗涤，剪碎脾脏、研磨，过40目滤网，制备受体Wistar大鼠无菌脾细胞悬液。
1.2.2.2  淋巴细胞分离与培养
受体Wistar大鼠无菌脾细胞悬液淋巴细胞分离液分离，Hanks液洗涤两次，RPMI1640培养液将细胞配成5x106/ml的细胞悬液备用,置于37℃,5%CO2的恒温培养箱中孵育。
1.2.2.3  大鼠心肌细胞原代培养及模型建立(1)
无菌解剖供体系SD大鼠心脏，经Langendorff灌注架37℃连续灌注无钙台氏液 60 mL, 消化酶30 mL循环灌注12 min，再用含0.06 mol/L Ca2+的台氏液60 mL灌注。在含100 μmol/L Ca2+的KB液中用剪碎心脏，37℃轻摇10 min，200 μm滤网过滤，将滤液900 r/min离心1 min，弃上清，加入含500 μmol/L Ca2+的KB液900 r/min离心1 min，再用含1 mmol/L Ca2+的KB液重复1次, 用差速贴壁分离法纯化并于血细胞计数板上计数, 1640完全培养液调细胞浓度为2×107/ml，分两培养瓶，其中一瓶内加入丝裂霉素(25mg/ml)去增殖活性备用。 
1.2.2.4  大鼠脾细胞悬液加入经丝裂霉素处理的大鼠心肌细胞共培养
用1640完全培养液配成1×106/ml的大鼠脾细胞悬液100μl加入1640完全培养液调配成浓度为2×107/ml大鼠心肌细胞培养液100μl，加IL-2(20U/ml)加双抗（青霉素100mg/L,链霉素100万U/L）。 
1.2.3 实验分组
每孔加入不同浓度RES、CSA培养,A:空白; B: CSA 100nM;C1: RES 50uM; C2: RES 100uM; C3: RES 25uM; D: CSA 100nM, RES 50uM; E: CSA100nM, RES 37.5uM
1.2.4 T淋巴细胞Bcl-2表达的测定
采用SABC免疫组化染色测定，试验设PBS代替一抗做阴性对照，预实验确定NFΚB一抗的最适工作浓度：NF-ΚB 1：100。
无菌制备试验组组受体Wistar大鼠脾细胞悬液加入经丝裂霉素处理的供体鼠系SD大鼠心肌细胞, 加入不同干预药物共培养5天后，吸取细胞悬液，淋巴细胞分离液分离淋巴细胞， 加入RPMI-1640不完全培养液1ml, 通过尼龙柱除去B淋巴细胞，贴壁法去除单核细胞，离心获取有核细胞, 采用细胞印片，镊子夹出细胞块后置PL玻片上，推片， 立即置于95%酒精与甲醛1：1的固定液，固定2小时后，双蒸水洗后脂肪笔画圈，PBS冲洗3次，每次5分钟（下同）；石蜡切片经二甲苯脱蜡至水后（所用PBS为0.02M）；0.1M枸橼酸配制0.1%triton-X-100，室温，30分钟；PBS冲洗；0.3%H2O2甲醇液洗10分钟，室温；PBS冲洗；2%小牛血清封闭，室温，20分钟；加一抗Bcl-2 1：100,4℃过夜， 次日移至室温30分钟，PBS冲洗；SABC 二抗1：200，室温30分钟；PBS冲洗；辣根过氧化物酶标记1：100，室温30分钟；双蒸水洗；PBS冲洗。 DAB显色；室温， 显微镜控制下；脱水，透明，封片，部分苏木素复染。
每张细胞涂片随机选取5个高倍视野，共记数500个细胞，计算阳性细胞数占细胞总数的百分比，T淋巴细胞 NFΚB阳性为细胞胞核和胞浆都有阳性着色，以胞核为主。 
1.2.6  统计学分析
本实验数据采用统计软件包SPSS12.0处理，以均数标准差(±s)表示，多样本单因素（one way-ANOVA）方差分析，组间比较采用SNK-q（Student-Newman-Ken(s)）检验，重复资料组间比较MANOVA检验，P<0.05认为具有显著性差异。
2 结果 
  实验组内加入不同干预药物对共培养细胞中T淋巴细胞NF-κB免疫组化染色结果
groupThe percent of T cell with NF-κB immunhistochemical staining(%)
A (blank) B (CsA 100nM) C1 (RES 50uM) C2 (RES 100uM) C3 (RES 25uM) D (CsA 100nM  RES 50uM) E (CsA 100nM  RES 37.5uM)31.41±2.64# 13.22±1.43* 17.69±1.60* 16.86±1.58* 22.72±1.83 6.36±0.94*# 10.58±1.21*
注：*与A组比较，P<0.05；#与B组比较，P<0.05
     3 讨论  
异位腹腔心脏移植是一种简便、实用、有效的观察排斥反应发生机制的动物模型，一直用于器官移植后的免疫排异反应研究。 SD与Wistar大鼠为封闭群大鼠, 是一种高排斥反应的组合，SD→Wistar的同种异体移植可以引发强烈的急性排斥反应, 本实验移植模型术后5日移植心脏镜下：移植心脏组织内排斥反应的强度（Standford标准分级）2级及其以上53例（60例）。   
本实验首先建立SD-Wistar大鼠腹腔异位心脏移植模型，5天后取已发生急性排异反应受体Wistar脾脏分离脾细胞（单个核细胞）作为反应细胞，同时分离供体系SD大鼠单个心肌细胞经丝裂霉素C处理后作为刺激细胞,体外持续刺激受体Wistar脾脏分离脾细胞，作为心脏移植后急性排异反应的体外模型，观察RES对T淋巴细胞NFκB表达的作用。 
核转录因子NFκB (nuclear factor kappb, NFκB) 是一种重要的核转录因子,参与免疫反应, 炎性反应等多种反应物质基因的表达调控,　NFκB在细胞增殖和凋亡相关基因的调控中也起着关键的作用(2)，NFκB是调节同种异体移植免疫排斥反应相关基因表达的关键转录因子。移植物排斥反应与NFκB的非正常激活有关，而且NFκB与急性排斥反应、移植物长期存活以及慢性排斥反应的发生有直接的关系。 
急性排斥反应中T细胞首先通过T细胞抗原受体(TCR)与抗原递呈细胞(APC)和T细胞表面受体之间的相互作用而激活， NFκB,　AP-1等核因子的磷酸化将细胞外信号传至细胞核,诱导编码细胞因子及受体的基因活化,促进细胞因子的表达、分泌,　最终导致T细胞的活化，分泌IL-2，表达IL-2R, 引起T细胞分化，增殖成Tc(细胞毒性T细胞)和TDTH(迟发型超敏T细胞), 产生细胞免疫反应，此外活化的NFκB以非结合状态进入细胞核中, 结合到特定的DNA序列区调节靶基因的表达，许多编码细胞因子、趋化因子、细胞黏附因子、共刺激因子和免疫球蛋白受体的基因可以诱导表达, 在其启动子或增强子DNA序列区常有NFκB的结合位点，这些因子对免疫和炎症细胞的活化、增殖、浸润、趋化起直接调控作用, 具有一系列调节免疫细胞生物学活性的功能, 参与调节机体的免疫应答(3) 。　
活化的NFκB诱导大量免疫和炎症相关基因的表达与慢性排斥反应的发生同样密切相关，NFκB的活化促进受其调控的促炎性细胞因子、黏附分子、趋化因子等基因的过渡活化和表达, 再进一步促进单核细胞、T淋巴细胞等免疫细胞与内皮细胞的粘附和浸润, 并使单核/巨噬细胞、T淋巴细胞等向移植物迁移, 从而促进单核/巨噬细胞、T淋巴细胞等的进一步活化和后继效应, 最终导致器官移植术后因单核/巨噬细胞、T淋巴细胞等对移植肾浸润所导致的非免疫性损伤和免疫性排斥反应，NFκB对T功能具有重要的调控作用。 
本组实验中针对P65亚基的免疫组化染色, 胞核阳性着色能简便而直观地反映出NFκB转位至胞核, 而NFκB胞核染色阳性细胞的百分比可间接反应NFκB的激活程度(4)。本实验发现不同剂量组RES及CSA均能使共培养中T淋巴细胞NFκB活性明显降低, 结合我们前期研究发现, 伴随Ｔ淋巴细胞中NFκB活性明显降低, T淋巴细胞增殖活性也受到抑制。同时我们也发现RES对腹腔异位心脏移植体外模型T淋巴细胞细胞NFκB的表达的确有一定的影响，有一定剂量依赖性，但其最大剂量效果仍差于CSA，RES与CSA联用效果明显优于两者单用，说明RES与CSA有一定协同作用。RES免疫调节机制比较复杂(5)，能双向调节T淋巴细胞的增殖,低浓度促进T淋巴细胞增殖,高浓度抑制增殖(6), 其高浓度抑制T淋巴细胞增殖作用机制可能与对NFκB表达的影响有关。
参考文献:
1.  王亭忠，席雨涛，吴格如. 大鼠成体心肌细胞的分离和培养. 第四军医大学学报 2005；25（ 17）：1544-1546.
2．Aggarwal BB. Nuclear factor-kappa B: the enemy within.Cancer Cell.  2004, 6(3): 203-8。
3．Tsoulfas G, Takahashi Y, Liu D, etal. Hydrodynamic Plasmid DNA Gene Therapy Model in Liver Transplantation. J Surg Res. 2006; 135(2): 242-249.
4．赛燕,陈志龙,刘勇等. 硫芥诱导淋巴细胞凋亡与细胞周期的关系. 中国公共卫生. 2003；19（5）：521-522.　
5．周玲芝，尹进.白藜芦醇酒剂对小鼠免疫功能影响的研究.湖南中医药大学学报2009, 29(1):41-45.
6．黎永胜，文军.白葵芦醇的药理作用研究进展.医学综述2008;14(3):469-472.