摘要 目的：研究淫羊藿素（icaritin，ICT）对鸡胚绒毛尿囊膜（chick chorioallantoic membrane, CAM）血管生成的抑制作用。方法：建立鸡胚绒毛尿囊膜模型，光镜下观察淫羊藿素对正常鸡胚绒毛尿囊膜微血管形态的影响，应用医学图像分析软件定量检测淫羊藿素对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响。结果：光镜下可见淫羊藿素作用后，鸡胚绒毛尿囊膜微血管数目减少，管径变细，分布零乱。定量检测结果表明，淫羊藿素浓度为10－6 、10－7、10－8 mol/l时血管生成抑制率分别为：3.27％、24.88％和41. 92％，血管数目明显少于DMSO对照组（P<0.01），却多于人参皂苷Rb1组（P<0.01）。结论：淫羊藿素可显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成，并呈现浓度依赖关系。
     关键词：淫羊藿素；血管生成；鸡胚绒毛尿囊膜
 Inhibitory Effect of Icaritin on the Angiogenesis in Chick Chorioallantoic Membrane 
             LV Xiang1,WU Jing-feng2, YI Ting-jiao3,Ling chang-quan
1 Department of cancer TCM of shanghai hospital  2 Department of TCM Huashang hospital affillited Fudan University  3  Department of TCM Changhai hospital affillited Second Military Medical University
    Abstract: Objective: To investigate the inhibitory effects of icaritin (ICT) on the angiogenesis of chick chorioallantoic membrane (CAM). Methods: The model of angiogenesis of CAM were established and randomly divided into 5 groups Morphological changes of blood vessels of CAM treated with icaritin for 72 hours were observed under the light microscope. Blood Vessels were counted by using medical image analyzing soft ware.Result: Decrease of blood vessels, more slender caliber and distribution of blood vessels in great disorder were observed under the light microscope after treatment with icaritin. The blood vessels in CAM of icaritin groups and Rb1 group was significantly less than that of DMSO group (P<0.01). But the blood vessels in CAM of  icaritin groups was more than that of the Rb1 group (P<0.01). Conclusion: Icaritin could inhibite the angiogenesis of CAM in a concentration-dependent manner.
   Keyword: Icaritin; angiogenesis; chick chorioallantotic membrane
淫羊藿是中医温补肾阳的代表性中药，来源于小檗科淫羊藿属的多种植物。有“益精气，坚筋骨，补腰膝，强心力”之功效。血管生成对肿瘤的发生、浸润、转移、复发和预后有着举足轻重的作用[12]。现代药理研究表明，淫羊藿及其有效成份具有多种药理作用，以往研究发现淫羊藿苷可以诱导体外肿瘤细胞凋亡等作用[1-5]。淫羊藿素是淫羊藿苷的体内代谢产物之一，属一种植物雌激素[6]。本文研究了该淫羊藿素对鸡胚绒毛尿囊膜（chick chorioallantoic membrane, CAM）血管生成的影响，以进一步证实其抗血管生成作用。
1 材料与方法
1.1 材料  白皮受精鸡蛋，购自上海旗杆种禽育种公司。药物：淫羊藿素，上海融禾医药科技发展有限公司，批号：20081212；人参皂苷Rb1，上海融禾医药科技发展有限公司，批号：20081115。明胶海绵，金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂产品，批号：080401。其它材料还包括新洁尔灭、75%乙醇、生理盐水和安而碘、眼科剪、眼科镊、牙科钻；V - 5060型二氧化碳培养箱，德国 Heraeus公司； XDS - 1B型倒置相差显微镜，日本Olympus公司；AIRTECH超净工作台，苏州苏净集团安泰公司；PowerShot A75型数码相机，日本 Canon公司；M IQAS医学图像定量分析软件由上海申腾信息技术有限公司提供。
1. 2  供试品载体的制备? 将Whatman滤纸用打孔器制成直径5 mm的圆片，高压灭菌备用。在无菌条件下，将ICT1（1×10-6 mol/l）、ICT2（1×10-7mol/l）、ICT3 （1×10-8mol/l）均匀涂布于滤纸上，阴性对照涂布同体积的DMSO，阳性对照涂布Rb1（5×10-7 mol/l），自然风干备用。
1.3 实验分组及药物处理? 60枚新鲜香港麻花鸡种蛋，随机分为5组：DMSO组、ICT1组、ICT2组、ICT3组、Rb1组，每组各12枚。种蛋消毒后，放入37.8 ℃恒温孵育箱中，气室向上，每天转动3次。取第六天的鸡胚，酒精擦拭后静置15 min。用剪刀和镊子在气室部位开窗（1.5 cm×1.5 cm），暴露出卵壳膜。选定加药部位，用注射器针尖轻轻挑破卵壳膜，滴加PBS两滴。轻轻剥离卵壳膜，暴露出尿囊膜。将含有待测品的滤纸放在尿囊膜血管较少部位（加药面向下）。无菌封口膜封口，放入孵育箱中继续孵化2 d。揭开封口膜，将窗口扩大，注入甲醇和丙酮的混合溶液（1∶1）室温固定15 min。待CAM血管内血液凝固后，以滤纸为中心把膜剪下，放入盛有水的平皿里展开，拍照并记录各组CAM血管生长情况。
1.4 检测指标及方法  应用MIQAS医学图像定量分析软件对CAM 照片进行扫描，分别计数以载体为中心直径5mm范围内的血管数目（Blood vessel number, BVN）。并且根据下列公式计算血管抑制率（Inhibition rate, IR）。
IR% = [阴性对照组血管平均数-实验组血管平均数/阴性对照组血管平均数]×100%
1.5　统计学分析 　所有数据采用 SPSS11.5统计软件处理。计量资料用x±s 表示。选择单因素方差分析进行方差齐性检验，多组均数间两两比较采用 Student- Newman-Keuls法。P <0. 05提示差异有统计学意义。
2? 结? 果
DMSO组CAM血管丰富，生长良好，颜色鲜红，网络清晰可见；ICT1、ICT2、ICT3处理组的毛细血管数目较DMSO组明显减少，颜色变浅、苍白，载体放置的中间部位几无血管生成，周边部位较少，部分血管结构遭到破坏，ICT1、ICT2、ICT3对CAM生成的抑制率分别为3.27％、24.88％和41.92％；阳性对照Rb1对CAM血管生成的抑制率53.70％。见表1和图1。
表1 淫羊藿素对CAM血管生成的影响
Table 1 Effects of Iicaritin on angiogenesis of CAM
   Group     nconcentration (mol/l)                D = 5 mm
numbers of blood vessel          Inhibition rate (%)
DMSO-treated12070.56±3.450
Rb1-treated group105×10-732.67±4.32★53.70
ICT1-treated group 121×10-668.25±3.82★▲3.27
ICT2-treated group 111×10-753.00±3.11★▲24.88
ICT3-treated group 101×10-840.98±5.57★▲41.92
      注：★与DMSO组比较 P <0.01，▲与Rb1组比较P <0.01。
A:DMSO-treated group B: ICT1--treated group C: ICT2-treated group D: ICT3-treated group E:Rb1-treated group 
图1 淫羊藿素对CAM血管生成的影响
Figure 1 Effects of Iicaritin on angiogenesis of CAM
3? 讨? 论
1971年Folkman [9] 首先提出肿瘤的生长与转移和其新生血管生成密切相关
目前，肿瘤血管生成的病理学研究及抗血管生成抑制剂的研发已成为抗肿瘤研究领域的热点之一。在血管生成研究中，主要的体内实验模型有CAM和卵黄囊膜法、鼠皮下气囊法、直接测定用药后正常组织或肿瘤组织中微血管密度法、大鼠肠系膜窗血管生成法、仓鼠颊膜模型、兔耳室模型、动物角膜或虹膜内移植等 [10] 。在众多模型中，CAM血管生成模型因实验材料易得、操作简便、实验周期短及结果易于观察等优点，成为研究药物抗血管生成作用的最常用体内模型。CAM是在胚龄4～5 d时，由绒毛膜体壁中胚层和尿囊膜脏层中胚层融合而成，其组织学结构有三层：外胚层，位于壳膜下方，由绒毛膜上皮组成；中胚层，富含毛细血管的结缔组织；内胚层，位于尿囊，由尿囊膜内皮形成。CAM为体外呼吸器官，会随胚龄增加而增大，且毛细血管极其丰富，可直观地观察到不同药物处理对CAM血管生成的影响。因为CAM血管分布因个体而异，加入载体后还可能出现非特异性炎症，而且结果很难精确测量，所以我们尽量选用同一批鸡胚，相同孵化条件，来减少实验误差。在本实验中，我们采用改良的CAM技术（无气室孵育法）进行实验，即直接在鸡胚气室端开窗加药，而传统方法需要磨切卵壳，CAM极易遭到破坏，所以本方法较之于传统的CAM法有种蛋成活率高、加药部位易观察及载体不易移位等优点。处理48 h后，DMSO处理的阴性对照组CAM血管及其网络清晰可见，生长良好，甚至部分载体部位尿囊膜还出现血管增加的情况，ICT处理组的毛细血管数目较阴性对照组减少，血管结构模糊，颜色变浅、苍白。Rb1是一类抗癌中药单体，有报道 [11] 称该药具有抗血管生成作用，故本实验将其作为阳性对照药物，但实验结果显示Rb1在5×10-7mol/l时对CAM血管生成的抑制率53.7%，推测其抑制血管生成的机制可能与淫羊藿素不同。ICT1、ICT2和ICT3对CAM血管生成的抑制率分别为3.27％、24.8％
和41. 92％，说明ICT1、ICT2、ICT3对体内血管生成有较好的抑制作用，值得
进一步研究。
【参考文献】
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3 李贵新，张玲等. 淫羊藿苷诱导肿瘤细胞凋亡及及其机制的研究. 中国肿瘤生物治疗杂志. 1999；4（3）：235.
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6 叶海涌 <javascript:WriterSearch(叶海涌);>,刘健 <javascript:WriterSearch(刘健);>,楼宜嘉 <javascript:WriterSearch(楼宜嘉);>.淫羊藿苷衍生物的制备及其雌激素样作用研究.浙江大学学报：医学版 CSID=%7bE6862680-D7BB-4D85-A504-38319E46A748%7d>. 2005；34（2）：131-136
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9 Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med. 1971; 285(21): 1182-1186.
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11 KW Leung, LWT Cheung, YL Pon, et. al. Ginsenoside Rb1 inhibits tube-like structure formation of endothelial cells by regulating pigment epithelium-derived factor through the oestrogenβ receptor. British Journal of Pharmacology, 2007; 125:207-125.